International Journal of Antimicrobial Agents｜段广才团队揭示Hfq依赖性sRNA1039和sRNA1600调控宋内志贺菌耐药和毒力的分子机制

发布时间：2023-11-11作者：管理员

近日，郑州大学公共卫生学院段广才团队在International Journal of Antimicrobial Agents上发表题为 Molecular Mechanism of Hfq-dependent sRNA1039 and sRNA1600 Regulating Antibiotic Resistance and Virulence in Shigella sonnei的研究论文。该研究发现了两个与细菌耐药和毒力有关的sRNAs (sRNA1039和sRNA1600)，为宋内志贺菌耐药和毒力网络的Hfq-sRNA-mRNA调控提供了新的见解，有助于促进开发更有效的治疗策略。

小分子非编码RNA (Small non-coding RNA, sRNA)与RNA噬菌体Qβ复制酶(Hfq)宿主因子相互作用，在细菌基因转录后调控中发挥重要作用。目前，已知伴侣蛋白Hfq对反式编码sRNA结构的稳定性和调控机制至关重要。Hfq蛋白可以促进sRNA与其靶mRNA之间的碱基配对，形成Hfq-sRNA-mRNA复合物，通常改变靶mRNA的翻译起始频率或稳定性，从而抑制mRNA的翻译，但也有mRNA活化的情况。对sRNA功能和机制的研究表明，Hfq依赖性sRNA主要通过与靶mRNA碱基配对来调控靶mRNA的表达，从而影响细菌的生物膜形成、生长、抗生素耐药性、毒力等重要表型。然而，在宋内志贺菌中具有调控功能的sRNA尚未得到广泛的研究。因此，我们还需要更详细的信息来直接观察Hfq依赖性sRNA调控宋内志贺耐药和毒力的过程。

在本研究中，通过构建缺失突变体(WT/ΔSR1039和WT/ΔSR1600)，我们发现WT/ΔSR1039突变体对氨苄西林、庆大霉素和头孢呋辛的敏感性增加了2倍，WT/ΔSR1600突变体对头孢呋辛的敏感性增加了2倍（表1）。

表1. 各菌株的最低抑菌浓度

我们测定了WT、WT/ΔSR1039和ΔSR1039/pSR1039的生物膜形成能力，结果显示，这些菌株之间的生物膜形成能力没有差异(P > 0.05)(图1A)，说明sRNA1039不参与细菌生物膜形成的调控。我们还检测了孔蛋白基因(ompA, ompC, ompD, ompF)，外排泵基因(acrA, acrB, acrD, tolC)和青霉素结合蛋白基因(pbp5和pbp6)的表达水平。结果显示，与WT相比，WT/ΔSR1039中外膜孔蛋白基因ompD的表达量显著升高(P < 0.01)，而ΔSR1039/pSR1039中ompD的表达量显著降低(P < 0.05)(图1D)。这些结果表明，sRNA1039可能负调控宋内志贺菌外膜孔蛋白基因ompD的表达，导致其对氨苄西林、庆大霉素和头孢呋辛的敏感性发生变化。

以HeLa细胞为体外感染模型，探索sRNA1039对宋内志贺菌毒力的影响，结果发现sRNA1039与宋内志贺菌的毒力无关(图1B和1C)。WT、WT/ΔSR1039和ΔSR1039/pSR1039菌株的生长曲线(图1E)显示，sRNA1039与宋内志贺菌的生长有关，并且sRNA1039表达水平越高，细菌生长越慢。此外，我们将WT和WT/ΔSR1039菌株置于体外模拟酸性、氧化应激、高渗和低渗条件下，比较细菌存活率的差异，结果表明sRNA1039不参与宋内志贺菌的体外胁迫(图1F)。

图1. (A) sRNA1039生物膜形成能力的测定。(B) sRNA1039在HeLa细胞中的粘附实验。(C) sRNA1039在HeLa细胞中的侵袭实验。(D) WT、WT/ΔSR1039和ΔSR1039/pSR1039中抗生素耐药相关基因的表达水平。(E) WT、WT/ΔSR1039和ΔSR1039/pSR1039的生长曲线。(F) WT、WT/ΔSR1039的体外应力实验。n，无统计学差异；*， p <0.05；**， p <0.01。

我们检测了WT、WT/ΔSR1600和ΔSR1600/pSR1600的生物膜形成能力，结果显示无统计学差异(P > 0.05)(图2A)。随后我们检测了WT、WT/ΔSR1600和ΔSR1600/pSR1600菌株在头孢呋辛处理下的持留菌形成情况。结果显示WT/ΔSR1600的存活率比WT低约3倍(P < 0.01)(图2B)，表明sRNA1600的失活可能通过减少持留菌的形成来增加宋内志贺菌对头孢呋辛的敏感性。我们还检测了WT、WT/ΔSR1600和ΔSR1600/pSR1600中抗生素耐药相关基因的表达水平，但结果没有统计学差异(P > 0.05)(图2C)。

图2. (A) sRNA1600生物膜形成能力的测定。(B) 头孢呋辛暴露实验。(C)耐药相关基因在WT、WT/ΔSR1600和ΔSR1600/pSR1600中的表达水平。n，无统计学差异；**， p <0.01。

与WT相比，WT/ΔSR1600对Hela细胞的粘附和侵袭能力明显降低(P < 0.01)(图3A和3B)。为了阐明sRNA1600如何影响宋内志贺菌的毒力，我们检测了III型分泌系统(T3SS)毒力相关基因的表达水平。在WT/ΔSR1600中ipaH9.8、ipaH4.5基因表达量显著降低(P < 0.01)，其他基因几乎检测不到，而ΔSR1600/pSR1600中T3SS基因表达量显著升高(P < 0.01)(图3C)。这些结果表明，sRNA1600可能通过正调控T3SS相关基因来调控宋内志贺菌的毒力。

从sRNA1600的生长曲线可以看出，sRNA1600与宋内志贺菌的生长有关，并且sRNA1600表达水平越高，细菌生长越慢(图3D)。体外应激实验表明，WT/ΔSR1600菌株在氧化应激条件下的存活率显著低于WT菌株(P < 0.001)(图3E)，说明sRNA1600有利于细菌在氧化应激条件下的存活。

图3. (A) sRNA1600在HeLa细胞中的粘附实验。(B) sRNA1600在HeLa细胞中的侵袭实验。(C) WT、WT/ΔSR1600和ΔSR1600/pSR1600中毒力相关基因的表达水平。(D) WT、WT/ΔSR1600和ΔSR1600/pSR1600的生长曲线。(E) WT和WT/ΔSR1600体外应激实验。n，无统计学差异；**， p <0.01；***， p < 0.001；N，基因CT值大于30。

综上，sRNA1039与sRNA1600与宋内志贺菌的耐药和毒力有关。sRNA1039的缺失负调控孔蛋白基因ompD的表达，增加细菌对氨苄西林、庆大霉素和头孢呋辛的敏感性；sRNA1600的失活减少了持留菌的形成，从而降低了对头孢呋辛的耐药性；通过降低III型分泌系统(T3SS)相关基因的表达，从而降低了细菌毒力。

郑州大学公共卫生学院段广才团队的青年教师陈帅印副教授为该论文的通讯作者。郑州大学公共卫生学院硕士研究生杜亚哲、王亚为该论文的共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金和河南省高校重点科研项目的资助。

论文链接：

https://authors.elsevier.com/sd/article/S0924-8579(23)00359-X